双表达去势DNA疫苗的构建及其稳定性研究

试验旨在构建一种更安全有效的新型免疫去势DNA疫苗,通过选取下丘脑-垂体-性腺轴（hypot halamic-pituitary-gonadal axis,HPG）的上游调控基因吻素1（KISS1）和促性腺激素释放激素（GnRH）作为靶标,借助2A肽的自剪切功能,引入平衡致死系统代替抗性基因筛选流程,成功将GnRH和KISS1转入非抗性筛选质粒pVAX-asd中,酶切验证和测序对比验证目的基因的插入方向和序列完全正确。重组质粒转染HeLa细胞,反转录后扩增目的基因结果显示,重组质粒在真核细胞内能够正常转录,保证重组质粒在导入机体后能够正常表达,从而引起特异性免疫反应。将构建成功的质粒转入减毒的猪霍乱沙门氏菌C500中,获得可直接口服免疫的活载体疫苗,酶切和测序结果表明,双表达重组质粒成功导入工程菌中。将活菌疫苗在体外连续传代50次,选取0、2、5、10、20、30、40、50代的菌株进行稳定性研究,生长曲线检测结果表明,工程菌在体外连续传代50次的过程中,其生长特性无明显变化,且与减毒猪霍乱沙门氏菌C500的生长特性一致,未因携带质粒发生明显变化;同时将各代菌液扩增沙门氏菌标志基因（invA）和毒力基因（crp）,结果表明多次传代后工程菌仍然具有沙门氏菌的特性,其减毒特性也无变化。各代菌液质粒酶切验证显示,多次传代并不影响质粒的稳定性,重组双表达质粒能够在沙门氏菌C500中维持正常拷贝功能。综上所述,该重组质粒和工程菌疫苗均具有良好的稳定性,可直接应用于动物免疫去势的研究。     

Nutritional and metabolic aspects of fatty liver disease in poultry

Summary

There are two metabolic disorders of major commercial importance in poultry that involve the occurrence of fatty deposits in the liver. Fatty Liver and Kidney Syndrome (FLKS) affects young birds and the main manifestations, lipid infiltrations into liver and many other organs, are apparently secondary effects of the primary lesion that lies in carbohydrate metabolism. Although several nutritional and environmental factors influence FLKS, the main factor is the vitamin, biotin. In the absence of an adequate supply of biotin, the hepatic activity of pyruvate carboxylase, a biotin‐dependent enzyme, becomes so low that gluconeogenesis in the liver via pyruvate becomes negligible. When the bird is then subject to a mild stress and 1or short term fasting, liver glycogen reserves become rapidly depleted and a progressive hypoglycaemia develops that ultimately proves fatal. Supplementing diets with adequate amounts of biotin can prevent the syndrome.

Fatty Liver Haemorrhagic Syndrome (FLHS) is brought about by an excessive accumulation of fat in the livers of adult hens which weakens the cellular structure of the liver and allows fatal haemorrhaging to occur. The aetiology of the syndrome is not clear, but a major factor is an excessive intake of dietary energy. However, Me involvement of hormonal and toxicological factors, as well as other nutritional factors, is also possible.     

鸡眼区相关淋巴组织对ND疫苗点眼免疫应答Ⅱ.眼区局部T淋巴细胞亚群的变化

本研究采用流式细胞仪技术对鸡眼区相关淋巴组织(HALT)在鸡新城疫疫苗点眼免疫后的局部T淋巴细胞亚群的变化进行了研究。研究发现,LaSota 系ND疫苗点眼免疫后眼区相关淋巴组织对ND疫苗可产生良好的细胞免疫应答。免疫组结膜相关淋巴组织(CALT)和哈氏腺(HG)中CD4 T及CD8 T淋巴细胞数量于首免后迅速升高。免疫期间其百分比含量明显高于非免疫组,到40 日龄时,有恢复到正常值的趋势。     

鸡败血霉形体F—36株的稳定性测定

以试管培养基中连续继代 ３６ 次的鸡败血霉形体 Ｆ３６ 定为疫苗制造的起始代次，将其在人工培养基中再传 ４、６、８、１０、１４ 代（简称 Ｆ４０、 Ｆ４２、 Ｆ４４、 Ｆ４６、 Ｆ５０），分别制成疫苗，各接种 ８ 日龄和 ３０ 日龄雏鸡，作免疫原性和病原性测定，观察 Ｆ株的稳定性。病原性测定结果表明，各代次疫苗以 ２～３ 倍的免疫剂量接种感染，不引起鸡的呼吸道症状和气囊炎，对鸡不致病；免疫原性测定结果表明，用各代次疫苗接种鸡都能产生良好的免疫力，能有效地抵抗强毒 Ｒ 株的攻击，保护气囊不受损伤。     

An experimental vaccine against Aeromonas hydrophila can induce protection in rainbow trout,Oncorhynchus mykiss (Walbaum)

A candidate vaccine against Aeromonas hydrophila in rainbow trout, Oncorhynchus mykiss, was developed using a bacterial lysate. To test the strength of protection, A. hydrophila challenge models were compared using injection into both the intraperitoneal (IP) cavity and the dorsal sinus (DS) with selected doses of live bacteria washed in saline or left untreated. Unlike the IP route, injection into the DS with either saline washed or unwashed cells resulted in consistent cumulative mortality and a dose response that could be used to establish a standard challenge having an LD₅₀ of approximately 3 × 10⁷ colony forming units per fish. Survivors of the challenge suffered significantly lower mortality upon re‐challenge than naïve fish, suggesting a high level of acquired resistance was elicited by infection. Passive immunization using serum from hyper‐immunized fish also resulted in significantly reduced mortality indicating protection can be transferred and that some portion of resistance may be antibody mediated. Vaccination of groups of rainbow trout with A. hydrophila lysate resulted in significant protection against a high challenge dose but only when injected along with Freund’s complete adjuvant. At a low challenge dose, mortality in all groups was low, but the bacterial lysate alone appeared to offer some protection.     

非洲猪瘟疫苗研究进展

非洲猪瘟（African swine fever,ASF）是由非洲猪瘟病毒（African swine fever virus,ASFV）引起的家猪和野猪的急性、出血性传染病,强毒株感染猪的致死率接近100%,给养猪业造成巨大经济损失。ASFV在猪群中可以快速有效传播,在环境中可稳定存在,为ASF的防控带来了挑战。研究人员一直致力于ASF疫苗的研究,迄今为止,仍没有有效的疫苗投入市场。综述了ASF灭活疫苗、减毒活疫苗、亚单位疫苗、DNA疫苗、病毒活载体疫苗的研究情况,以期为ASF疫苗的有效研发提供参考。     

牛病毒性腹泻/黏膜病(1型+2型)、牛传染性鼻气管炎、牛副流感(3型)三联灭活疫苗(E2蛋白+C1株+HB01株)的研制与免疫效果评价

采用CHO细胞表达牛病毒性腹泻/黏膜病病毒1型（BVDV1）E2蛋白,采用杆状病毒重组表达牛病毒性腹泻/黏膜病病毒2型（BVDV2）E2蛋白,采用MDBK细胞微载体悬浮培养技术培养牛传染性鼻气管炎病毒（IBRV）和牛副流感病毒3型（BPIV3）,收获蛋白表达产物和细胞培养物,经纯化、灭活后与605佐剂混合,制备牛病毒性腹泻/黏膜病(1型+2型)、牛传染性鼻气管炎、牛副流感(3型)三联灭活疫苗(E2蛋白+C1株+HB01株)。将疫苗免疫健康易感牛进行免疫效果评价,结果表明该产品免疫效果良好,免疫牛IBRV和BPIV3中和抗体效价均可达到1∶77以上;BVDV1和BVDV2 E2蛋白琼扩抗体效价均可达到1∶32以上;免疫牛攻毒保护率均可达到4/5以上。     

鸡毒支原体灭活疫苗效力检验气囊注射攻毒方法的研究

鸡毒支原体灭活疫苗效力检验采用的喷雾攻毒方法所需菌液量大,结果易受喷雾时间和器械设备影响。为了探索一种简便、易行且结果稳定的新方法,本研究冻干了一批攻毒用菌株鸡毒支原体R株,对其性状、纯粹、真空度、剩余水分、培养特性、特异性、活菌计数和均一性等进行检定,结果全部符合规定。将其稀释成不同活菌数,采用气囊注射方式攻毒,观察试验结果并与《中国兽药典(三部)》中的喷雾方法进行比较。结果表明,建立的气囊注射攻毒法稳定、准确,通过5批次疫苗效力检验试验比较,与喷雾方法结果无显著差异,可为该类疫苗攻毒方法优化提供新思路。     

鸭疫里默氏杆菌贵州流行株蜂胶灭活疫苗制备

【目的】制备鸭疫里默氏杆菌(Riemerella anatipestifer,RA)贵州流行株蜂胶灭活疫苗。【方法】选取RA血清2型贵州流行株(RA-SS-8株)为基础菌株,依次利用分光光度法和平板计数法测定细菌生长曲线,再进行灭活条件筛选,以蜂胶为佐剂制备RA贵州流行株蜂胶灭活疫苗,并进行无菌检验、安全性检验及免疫鸭攻毒保护性试验。【结果】分光光度法测定RA-SS-8株菌液D_{600 nm}值随培养时间变化显示,细菌在0~3 h时增殖缓慢,在3~10 h时增殖趋势明显加快,在10 h以后增殖逐渐趋于平缓,随着培养时间的延长,细菌最终进入衰亡期;平板计数法结果显示,RA-SS-8株D_{600 nm}值为0.1~0.8时,该菌处于对数生长期,且D_{600 nm}值与活菌数呈现良好的线性关系;RA-SS-8株最佳灭活条件为0.2%甲醛溶液、37 ℃灭活12 h;蜂胶灭活疫苗含菌量为3.8×10⁹ CFU/mL,蜂胶干物质含量为10 mg/mL;无菌检验巧克力琼脂培养基上未见菌落生长;安全性检验以2倍免疫剂量接种雏鸭在观察期内未表现出不良反应,大体病变观察未见明显病变;免疫鸭攻毒保护性试验显示,蜂胶灭活疫苗免疫组鸭对RA-SS-8株的攻击后保护率为70%,蜂胶灭活疫苗对试验鸭心脏、肝脏组织均具有良好的保护效果。【结论】本研究成功制备了RA贵州流行株蜂胶灭活疫苗,为蜂胶灭活疫苗制备和动物免疫试验奠定基础。     

A型塞尼卡病毒检测方法及疫苗研究进展

A型塞尼卡病毒（Senecavirus A,SVA）也称为塞尼卡谷病毒（Seneca Valley virus,SVV）,属于小RNA病毒科塞尼卡病毒属成员。SVA主要引起猪的水泡性疾病,与口蹄疫、水泡性口炎、猪水泡病等临床症状相似,可导致新生仔猪急性死亡,严重影响养猪业发展。自2015年广东省发生SVA感染以来,中国多省份陆续有该病发生的报道。当前,中国因猪群缺乏针对SVA的免疫屏障,加之该病传染性较强,存在大范围暴发的潜在风险。如何有效防控SVA感染是迫切需要解决的问题。目前已开发出多种SVA诊断方法用于进行实验室及现场条件下早期的鉴别诊断。SVA的分离鉴定、原位杂交和免疫组化可用于检测病原体的存在及其与组织内形态学变化关系;血清学诊断方法包括基于不同结构蛋白的间接ELISA方法、竞争ELISA方法、均相光激化学发光免疫技术和病毒中和试验,用免疫学方法检测抗体有助于了解SVA感染进程,是临床诊断的主要手段;病毒核酸检测方法主要有PCR技术、等温扩增技术、基因组测序等分子生物学技术,在病毒感染的早期快速检测及检测新发病毒中具有重要作用。目前仍无商品化疫苗预防SVA感染,但科研人员已研发出了灭活疫苗、弱毒疫苗、核酸疫苗和亚单位疫苗等多种具有潜力的候选疫苗。笔者系统总结了SVA检测方法及疫苗研发的最新进展,以期为SVA感染的防控提供参考依据。